PNAS经典品读利用结构生物学解析抗锈
缺少获得性免疫系统的植物体主要依赖天然免疫系统（innateimmunesystem）来保护自身免受病原体侵染。植物天然免疫系统使用分布在细胞表面和细胞内的受体蛋白来识别病原体相关的分子或者病原体分子所造成的细胞功能变化，并以此来确认病原体感染、启动特定的免疫反应。植物免疫受体由植物疾病抗性（R）基因进行编码。20多年前，人们鉴定和克隆了第一个植物疾病抗性基因。随后，从属于不同植物-病原系统的越来越多的R基因被鉴定和进行功能分析。大部分的R基因编码一个大家族的细胞内NLR受体蛋白（NOD-likereceptors），脊椎动物细胞内的许多免疫受体也属于这个大家族。植物细胞内的NLR受体可以识别病原体分泌到细胞内的效应蛋白并触发效应蛋白诱导的免疫反应（ETI）。此外，NLR蛋白的激活还会在感染部位诱导产生超敏反应（hypersensitiveresponse，HR），最终诱导整株植物产生免疫保护。
NLR受体蛋白通常含有三个结构域：一个位于序列中间的核苷酸结合结构域（NOD），一个位于C端的亮氨酸富集重复（LRR）结构域，和一个N端结构域（含有CC元件或者TIR元件）。NOD结构域具有活性调节和介导蛋白寡聚化的特点，LRR结构域可执行配体识别功能与活性调节功能，N端结构域则执行信号传导功能。人们现在主要针对单个的结构域对NLR受体进行结构和功能的分析，目前还没有植物NLR全长蛋白的结构。
NLR受体蛋白N端的CC结构域或TIR结构域是其诱导产生细胞死亡反应的充分必要条件。单独的N端结构域在植物中瞬时表达就可以诱导非病原体依赖的细胞死亡，而N端结构域的同源二聚化被认为是激活下游防御反应的前提。尽管不同TIR结构域的序列一致度很低，但却具有保守的折叠结构；有意思的是，最早解析的两个CC结构域的晶体结构（MLA10-CC结构年由德国马克思普朗克研究所PaulSchulze-Lefert研究组完成解析，Rx-CC结构年由清华大学柴继杰研究组完成解析）却有很大的差异。MLA10-CC是由两个α螺旋组成的二聚体，而Rx-CC却是由四个α螺旋组成的单体。
年，澳大利亚昆士兰大学Casey等报道了第三个植物NLR受体CC结构域的NMR（核磁共振）结构。这个NLR受体基因Sr33来源于单粒小麦（Triticummonococcum），介导了该小麦对小麦秆锈菌Ug99菌株的抗性（年发表于Science）。Sr33-CC（6-）在NMR测定条件下表现为单体，由四个α螺旋紧密堆叠成束。尽管Sr33-CC与MLA10-CC具有82%的序列一致度，其结构却更类似于远源的Rx-CC（序列一致度约为18%）。那么NLR受体蛋白在溶液状态下究竟是单体还是二体？
为了分析NLR受体CC结构域溶液状态下的性质，Casey等用体积排阻层析偶联多角度光散射（SEC-MALS）实验测定得到四种CC结构域的平均分子量。发现四个蛋白的平均分子量都非常接近其单体的理论分子量，说明这些蛋白在溶液中主要以单体的形式存在。
使用体积排阻层析偶联小角度X-射线散射（SEC-SAXS）实验测定Sr33-CC、MLA10-CC和Rx-CC的分子量也可以得到类似的结论。此外，SAXS数据还可以得到与溶液中粒子形状相关的信息。有意思的是，这些数据显示三种CC蛋白的形状也非常相似。它们的性质与Sr33-CC和Rx-CC结构中的四螺旋束堆叠形式相符，但与MLA10-CC晶体结构中的单体或二体形式都不符。MLA10-CC晶体结构中的蛋白呈长条棒状，无法匹配SAXS计算出来的粒子形状。
Maekawa等在分析MLA10-CC的聚集状态时使用了分析型体积排阻层析（analyticalSEC）的方法，测定得到MLA10-CC的洗脱体积与25kD糜蛋白酶marker接近，因此推断MLA10-CC在溶液中为二聚体状态。使用BS3进行蛋白交联也可以得到类似结果。Casey等重复了Maekawa他们的实验，但同时也对Sr33-CC和Rx-CC两种蛋白（据报道这两种蛋白在溶液状态下是单体）进行了测定。Casey等发现所有三种蛋白的洗脱体积都很接近，对应于二聚体。
Casey等认为这些结果恰恰说明MLA10-CC、Sr33-CC和Rx-CC这三种蛋白在溶液状态下都是单体，因为体积排阻层析实验中大分子的移动速率不仅仅受其分子量的影响，还受其形状、柔性、分子组成以及吸附与解吸附速率的影响；而化学交联很可能因为瞬时或者非特异性相互作用的存在而总结出蛋白寡聚的假阳性结果。Casey等曾怀疑Maekawa等在年MLA10-CC的晶体结构是否由低pH和高盐的结晶条件诱导形成，但是他们在中性pH和无盐条件下得到的晶体结构却也是二聚体，而且和Maekawa等测定的结构十分相似。
既然NLR受体CC结构域诱导细胞死亡的功能依赖于其二聚体的形成，那么溶液状态下致密、球状、四螺旋束的单体结构如何完成生物学功能？答案隐藏在CC结构域C末端的延长序列上。Cesari等在年发现Sr33、Sr50和MLA10的CC结构域附近-位氨基酸残基是其信号传导和同源聚集所必须的。Casey等于是表达纯化了Sr33（6-）、Sr33（6-）和MLA10（5-）三个蛋白片段，利用SEC-MALS发现这三个长片段的同源聚集（self-association）能力都得到了增强，溶液中出现了多分散的蛋白组分。
为了测定Sr33、Sr50和MLA10传导细胞死亡和病原体抗性信号所需的最短N端片段，Casey等针对每个蛋白设计了7个截短体，然后将这些截短体在烟草中瞬时表达。植物体内表达结果证明：维持这三个蛋白信号传导活性所需的最短N端片段边界对应于MLA10蛋白的第位氨基酸。
为了研究上述片段诱导细胞死亡的能力与其在植物中同源聚集能力的相关性，Casey等还设计了一个免疫共沉淀的实验，发现可以自激活的片段具有很强的同源聚集能力，而没有活性的片段同源聚集能力要弱很多。
既然溶液状态下NLR受体CC结构域倾向于以单体的形式存在，那么MLA10-CC（5-）在晶体结构中为什么会是二体？目前认为有两种可能性比较大的假说。第一种假说认为MLA10-CC（5-）的两个晶体结构不是天然状态下的结构，而是片段序列本身和结晶过程共同决定的假象。第二种假说则比较有意思，认为MLA10-CC（5-）代表的是活性状态下的二体形式。如果这个假说成立，那么Sr33-CC和Rx-CC所呈现的单体结构应该是无活性的状态，这种状态会在全长蛋白发生结构转变时变成类似于MLA10-CC所呈现的激活状态。激活状态下的N端结构以及N端被激活的分子机理还有待结构生物学提供更多线索。
小编后记（前面“编者按”，后面后记，小编好啰嗦╮(╯▽╰)╭）：这篇文章，里面用了很多的蛋白方面的技术，读完文章和振华的解读，小编也在和振华讨论，这个研究对于小麦抗秆锈病的指导意义在哪里。振华说这项研究从基础研究角度将作物NLR蛋白信号转导相关的CC结构域工作机制往前推进了一步。我在想，文章里证明的CC结构域关键的位氨基酸是不是可用于单倍型分析？以及全长和CC段不同活性的分析，是否也可以在不同抗性小麦中得到解释？所以做结构的或许也需要多与我们讨论。欢迎大家留言。
作者介绍：明振华，广西大学教授，博士生导师，毕业于清华大学医学院，师从饶子和院士，曾在Nature和CellResearch等杂志发表研究论文。现就职于广西大学生命科学与技术学院，研究方向为植物致病菌及植物免疫相关蛋白质的结构解析和生化研究。
“植物免疫”知多少
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