PBJTaD27B基因控制小麦分蘖数
小麦是我国主要的粮食作物之一，其产量由亩穗数、穗粒数和千粒重决定。分蘖数在一定程度上决定了最终的亩穗数并进而影响产量。在模式植物拟南芥和水稻中，独脚金内酯(SLs)作为一类植物激素可以抑制侧枝的生长。然而，在小麦中，SLs的生物合成和转运中的调节基因以及这些基因是否参与小麦分蘖知之甚少。DWARF27（D27）基因编码一种含铁的β类胡萝卜素异构酶，参与SLs的合成。为更进一步理解SLs调控小麦分蘖的分子机理，本研究主要对TaD27-B基因的生物学功能进行了研究，具体结果如下：
1.TaD27s的结构分析
小麦TaDWARF27s（TaD27s）具有三个等位基因TaD27-A、TaD27-B、TaD27-D。利用氨基酸序列比对技术构建了植物D27蛋白系统发育树，同时利用GSDS网站构建了不同物种D27的内含子-外显子基因结构图。结果显示，几乎所有D27基因的结构都是由七个外显子和六个内含子组成（除Triticumurartu外），并且每个外显子长度大致相同，说明D27基因结构在进化过程中具有很强的保守性。
2.TaD27s的表达模式分析
为检测TaD27-A、TaD27-B、TaD27-D在小麦植株不同部位的表达量，我们根据它们基因中的差异序列设计了各自的特异定量引物。对KN小麦的幼根、三叶一心时期的腋芽、单棱期的分生组织、幼叶、小穗原基进行TaD27-A、TaD27-B和TaD27-D表达水平的定量检测。结果显示TaD27-A、TaD27-B、TaD27-D基因在小麦的各个组织中均有表达。原位杂交结果显示TaD27s在小麦的幼叶、分生组织、腋生分生组织、小穗原基中均有表达（图1b）。亚细胞定位分析显示TaD27-B蛋白定位于叶绿体上（图1c）。
3.TaD27-B转基因植株表型分析
考虑到TaD27-A、TaD27-B和TaD27-D序列同源性极高，且TaD27-B在叶和腋芽中表达水平最高，因此选取TaD27-B为重点研究对象。构建了TaD27-
B-RNAi和TaD27-B-OE的表达载体。与野生型KN相比，在返青期、拔节期和成熟期TaD27-RNAiT3代株系的分蘖数目均有不同程度的增多，而TaD27-B-OET3代株系分蘖数目均有不同程度的减少（图2,3）。此外，通过统计发现，TaD27-RNAi和TaD27-B-OE转基因植株株高、每穗粒数、千粒重与野生型相比均没有显著变化。
图1TaD27s的表达模式分析及TaD27-B蛋白的亚细胞定位。
图2TaD27-RNAi小麦植株表型分析。（a-c）野生型KN和TaD27-RNAi幼苗在返青期（a）、拔节期（b）和成熟期（c）的分蘖表型。红色箭头表示分蘖。（d-f）柱状图显示了野生型KN和三个独立TaD27-RNAi转基因株系在返青期（d）、拔节期（e）和成熟期（f）分蘖数的统计分析。（n=30）。（g）野生型KN和三个独立TaD27-RNAi转基因株系株高统计分析。（h）KN、48#、50#和55#苗期植株中TaD27s的表达水平分析。单星、双星和三星号代表t-检验中野生型和T3代TaD27-RNAi转基因植物之间的显着差异，P0.01。
图3TaD27-B-OE小麦植株表型分析。（a-c）野生型KN和TaD27-B-OE幼苗在返青期（a）、拔节期（b）和成熟期（c）的分蘖表型。红色箭头表示分蘖。（d-f）柱状图显示了野生型KN和三个独立TaD27-B-OE转基因株系在返青期（d）、拔节期（e）和成熟期（f）分蘖数的统计分析。（n=30）。（g）野生型KN和三个独立TaD27-B-OE转基因株系株高统计。（h）KN、31#、59#和92#苗期植株中TaD27s的表达水平分析。单星和双星号代表t-检验中野生型和T3代TaD27-B-OE转基因植物之间的显着差异，P0.01。
4.TaD27-B参与独脚金内酯的合成
列当种子只有在独脚金内酯化学信号物质或者萌发刺激物质（独脚金内酯类似物GR24）的诱导下才能萌发，为探究TaD27-B转基因小麦中独脚金内酯含量的变化，提取不同株系TaD27-B转基因小麦的根部提取液并进行了列当处理萌发实验。实验结果显示，去离子水处理的对照中，列当种子萌发芽率为0%，而在列当标准萌发刺激物GR24处理的对照中，列当的萌发率达到了%。KN根部浸提液列当萌发率约为40%，TaD27-RNAi转基因小麦三个独立株系的根部浸提液列当萌发率均明显低于野生型KN；而TaD27-B-OE转基因小麦三个独立株系的浸提液列当萌发率明显高于野生型KN。该结果表明，与野生型相比，TaD27-RNAi转基因小麦SLs的含量可能有所减少，TaD27-B-OE转基因小麦SLs的含量可能有所增加。同时水培条件下，TaD27-RNAi转基因小麦的腋芽生长速度明显加快，而TaD27-B-OE转基因小麦的腋芽生长速度明显减慢。外源施加独脚金内酯类似物GR24及其抑制剂TIS分别可以恢复TaD27-RNAi和TaD27-B-OE的腋芽表型(图4)。以上实验结果说明TaD27-B很可能通过参与SLs的生物合成调控小麦腋芽的数目。
5.TaD27-RNAi腋芽转录组分析
为了进一步分析小麦分蘖发生的分子基础，选取3周龄TaD27-RNAi的腋芽进行了RNA-seq分析，以同一发育阶段野生型KN的腋芽为对照。测序结果显示，许多基因参与到小麦SLs信号通路中共同调控小麦腋芽发育，例如生长素合成及信号转导基因。基因共表达网络分析显示19个转录因子与TaD27-B关系更为密切，研究结果为下一步探索小麦分蘖调控的机理奠定了基础。
一直以来，小麦分蘖基因的发掘与功能鉴定要比很多作物复杂。鉴于禾本科物种间的保守性，小麦中可能具有与水稻保守的基因功能或调控网络。考虑到小麦基因组是水稻基因组的40倍，重复序列多，我们认为一些重要基因的功能虽然保守，但具体表型和对发育的影响可能具有物种特异性，其调控机制在进化过程中也可能会发生改变。我们的研究结果也很好的证明了这一点。水稻d27突变体植株矮小,而我们的研究结果TaD27-B表达量的表达量变化并未明显影响株高。此外TaD27-B转基因株系的穗部性状也未受影响，暗示TaD27-B在小麦遗传改良方面具有良好的应用潜力。
图4（a）用去离子水，GR24和野生型（KN），TaD27-RNAi，TaD2-B-OE的根提取物处理列当种子10天后的萌发率。去离子水和GR24分别是阴性和阳性对照。（n=3）。（b）KN和TaD27-RNAi三个独立的转基因株系的腋芽。标尺=1mm。（c）KN和TaD2-B-OE三个独立的转基因株系的腋芽。标尺=1mm。
年7月27日PlantBiotechnologyJournal杂志在线发表了山东农业大学生命科学学院张宪省教授课题组这一研究成果（TaD27-BGeneControlstheTillerNumberinHexaploidWheat，DOI:10./pbi.）。课题组已毕业硕士生赵玢和武亭亭同学为该论文的共同第一作者，王芳副教授和张宪省教授为通讯作者。该项研究得到了国家转基因专项、山东省自然科学基金重大基础研究等项目资助。
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